DNA-sequencen is het bepalen van de nucleotidenvolgorde van een stuk DNA.

Sequence-PCR

Volgens de klassieke sequencing-methoden wordt de basenvolgorde bepaald door af te lezen welke basen er tijdens een speciale PCR-reactie worden ingebouwd.

Tijdens een sequence-PCR worden naast gewone deoxynucleotiden ook dideoxynucleotiden aan de reactie toegevoegd. Omdat een dideoxynucleotide een OH-groep mist – de plek voor het hechten van een nieuw nucleotide – stopt de DNA-synthese zodra een dideoxyribonucleotiden wordt ingebouwd. Door de replicatie te blijven herhalen, wordt uiteindelijk op elke plek in de DNA-sequentie een keer een dideoxynucleotide ingebouwd. Hierdoor ontstaan heel veel DNA-fragmenten, die elk 1 nucleotide in lengte verschillen.

Door gelelektroforese worden de fragmenten gescheiden op lengte. En nu de truc: aan de dideoxynucleotiden is een stof gebonden die in een bepaalde kleur fluoresceert. Elke stikstofbase heeft een eigen kleur. Dat betekent dat elk DNA-fragment de kleur heeft van de laatst ingebouwde nucleotide. Een detector leest vervolgens op volgorde alle kleuren af.

Next-generation-sequencing

De nieuwe generatie sequencing-technologieën, de zogenaamde ‘next-generation-sequencing technieken, zijn goedkoper en sneller dan de PCR-methode. Ze zijn in staat grotere stukken DNA tegelijkertijd te sequencen en dus geschikter voor het ontrafelen van hele genomen. Hierdoor kan binnen korte tijd een enorme hoeveelheid DNA-sequentie worden geproduceerd.