Zo werkt DNA sequencen

DNA sequencen

Sequencen heeft hetzelfde verloop als een PCR reactie. Het verschil is dat er dideoxynucleotiden worden toegevoegd aan de reactie. Een dideoxynucleotide is een molecuul dat lijkt op een normaal nucleotide, maar geen OH-groep heeft aan het 3-uiteinde. Het gevolg hiervan is dat de replicatie stopt wanneer er een dideoxynucleotide wordt ingebouwd.

Fluorescerend label

Bij het sequencen zijn de meeste nucleotides normaal en zijn er slechts een klein aantal dideoxynucleotides aanwezig. Elk van de vier dideoxynucleotides (ddA, ddC, ddG en ddT) heeft een apart fluorescerend label. Daardoor is na het sequencen in één opslag te zien waar de vier verschillende dideoxybasen zich bevinden.

Verzameling van stukjes DNA

Als de PCR reactie op gang gekomen is, zullen op een gegeven moment alle kopieën worden afgesloten met een bepaalde dideoxynucleotide. Het punt waar het enzym een dideoxynucleotide inbouwt en dus de plaats waar de keten stopt, is geheel willekeurig. De ene keer zal een korte keten gemaakt worden, de volgende keer een lange. Uiteindelijk komen dus alle mogelijke eindpunten aan de beurt. Je hebt dan dus een verzameling van stukjes DNA van alle mogelijk verschillende lengtes met ieder een dideoxynucleotide op het eind.

Aflezen met gelelektroferese

Om er achter te komen waar alle verschillende dideoxynucleotides in de keten zich bevinden, moeten we weten wat de verschillende lengtes zijn van al onze afgebroken ketens. Dit wordt gedaan door middel van gelelektroforese. Als de kortste keten eindigt met een ddA, weet je dus dat de volgorde van het DNA begint met een A. Zo kun je voor iedere positie in de DNA volgorde achterhalen welke nucleotide (A, C,T of G) er zit. Het aflezen van de gel gebeurt automatisch.